La iglesia es de tres naves, crucero y ábside poligonal. Se cubren las naves con bóvedas de crucería y todos los arcos son apuntados. Sobre el crucero va una cúpula sobre trompas, hoy tabicadas, por lo que dan toda la impresión de pechinas llevando el anillo ventanales. Dos grandes ósculos se abren en los extremos del crucero. Es como se ve, obra del s. XIV, habiéndose empezado en los tiempos de los primeros priores seculares, terminándose ya en los tiempos de Fray Fernand Yáñez.

En toda ella se hizo una reforma en cl siglo xviii, pavimentándola con losas de mármol y adornando sus frisos y nervaduras con tallas de madera dorada, obra del escultor don Manuel de Lara Churriguera.

Una de las rejas más hermosas de España, separan cl crucero de las naves. Obra admirable de forja, es de varales entorchados a la manera gótica, y con remates y cresterías primorosamente caladas, que llevan los escudos de la Virgen y de San Jerónimo. Fue labrada por dos frailes dominicos, Fray Francisco de Salamanca y Fray Juan dc Avila, en cl año 1510.

Por una hermosa gradería de mármol se asciende al presbiterio. El fondo absidal está ocupado por el gran relablo de roble y de cedro, asentado sobre un zócalo de mármol. Tiene banco y tres cuerpos, más el de remate con el Calvario, y tres calles, presidiendo la central el trono de la Virgen, sobre el que va el relieve de San Jerónimo. Las calles laterales son de pintura con escenas de la vida de la Virgen y otras del Nuevo Testamento, y éstas s separan entre sí por entrecalles con estatuas de los Santos Padres de la Iglesia y otros de peculiar devoción de la Orden Jerónima. 

Toda la obra de escultura se debe a Giraldo de Merlo y la de pintura a los maestros Carducho y Caxes, que ejecutaron respectivamente los cuadros del Evangelio y de la Epístola.

Para sagrario se ha habilitado una de las joyas más valiosas de cuantas atesora el Monasterio. Tal es la papelera o bufetillo que fue de Felipe II, quien lo regaló en el año 1569. Está hecho de chapa de bronce, damasquinado de oro y plata, con labor repujada en las portezuelas y cajonería y estatuas de bronce en los remates. Es de un acusado sabor renacentista.

Los relieves repujados en bronce dorado representan parejas de musas, que llevan en sus manos símbolos, libros o filacterias con textos evangélicos o de San Pablo, alusivos a la Resurrección del Señor y al triunfo de Jesucristo sobre la muerte. En el relieve de la portezuela se representa la escena del Noli me tángere y sobre las vertientes de los frontones van reclinadas liguras a la manera miguelangelesca. La belleza de este mueble y la severidad dc su estilo exceden a toda ponderación. Está firmado en Roma por Juan Giamini, en cl año 1561.

En los muros laterales del presbiterio se abren los oratorios reales y arcosolios de Enrique IV y de su madre doña María. Forman amplias fachadas que cubren los paramentos con revestimientos de mármoles, con balaustradas, rejas y balconajes, conteniéndose en los arcosolios las estatuas orantes de los reyes, y todo cl conjunto se timbra con los escudos de Castilla y León. Consta que la obra de estas suntuosas fachadas fue ejecutada entre los años 1617 y 1618, por Bautista Sesmeria y Bartolomé Abril. Las orantes se atribuyen a Giraldo de Merlo.